PCR儀工作原理
2012-06-19
PCR儀工作原理
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聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction ,簡稱PCR)是80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術。 它具有特異、敏感、產率高、 快速、 簡便、重復性好、易自動化等突出優(yōu)點;能在一個試管內將所要研究的目的基因或某一DNA片段于數(shù)小時內擴增至十萬乃至百萬倍,使肉眼能直接觀察和判斷;可從一根毛發(fā)、一滴血、甚至一個細胞中擴增出足量的DNA供分析研究和檢測鑒定。過去幾天幾星期才能做到的事情，用PCR幾小時便可完成。PCR技術是生物醫(yī)學領域中的一項革命性創(chuàng)舉和里程碑。
二、PCR基本原理
基本原理類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成：
1、模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93℃左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備;
2、模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合;
3、引物的延伸：DNA模板--引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈重復循環(huán)變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需2～4分鐘，2～3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍(Plateau)。到達平臺期所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。
在此同時認識到蛋白質是接受RNA的遺傳信息而合成的。50年代Zamecnik等在形態(tài)學和分離的亞細胞組分實驗中已發(fā)現(xiàn)微粒體(microsome)是細胞內蛋白質合成的部位;1957年Hoagland、Zamecnik及Stephenson等分離出tRNA并對它們在合成蛋白質中轉運氨基酸的功能提出了假設;1961年Brenner及Gross等觀察了在蛋白質合成過程中mRNA與核糖體的結合;1965年Holley首次測出了酵母丙氨酸t(yī)RNA的一級結構;特別是在60年代Nirenberg、Ochoa以及Khorana等幾組科學家的共同努力破譯了RNA上編碼合成蛋白質的遺傳密碼，隨后研究表明這套遺傳密碼在生物界具有通用性，從而認識了蛋白質翻譯合成的基本過程。
從分子生物學的發(fā)展過程，可以看到在近半個世紀中它是生命科學范圍發(fā)展最為迅速的一個前沿領域，推動著整個生命科學的發(fā)展。至今分子生物學仍在迅速發(fā)展中，新成果、新技術不斷涌現(xiàn)，但分子生物學的歷史還短，積累的資料還不夠。例如：在地球上千姿萬態(tài)的生物攜帶龐大的生命信息，迄今人類所了解的只是極少的一部分，還未認識核酸、蛋白質組成生命的許多基本規(guī)律;又如即使到2005年我們已經獲得人類基因組DNA3×109bp的全序列，確定了人的5-10萬個基因的一級結構，但是要徹底搞清楚這些基因產物的功能、調控、基因間的相互關系和協(xié)調，要理解80%以上不為蛋白質編碼的序列的作用等等，都還要經歷漫長的研究道路。可以說分子生物學的發(fā)展前景光輝燦爛，道路還會艱難曲折。
平或放大真核細胞單拷貝基因，通過PCR方法都是不難完成的。
4、特異性強 作為引物的寡核苷酸與模板結合的正確性是決定反應產物是否特異的關鍵。
5、對原始材料質量要求低含微量(pg,ng)的目的DNA的粗制品或者總RNA，就可以用做反應起始材料來獲取目的產物。
主要適用于生命科學、醫(yī)學、農業(yè)科學、環(huán)境科學、考古學及歷史事件解讀和衛(wèi)生安全方面。
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