如何選擇合適的定量PCR儀
2012-06-19
定量PCR儀主要由兩部分組成，一個是PCR系統，一個是熒光檢測系統。從生物通前面的原理介紹不難看出選擇定量PCR儀的關鍵——由于定量PCR必需借助樣本和標準品之間的對比來實現定量的，對于定量PCR系統來說，重要的參數除了傳統PCR的溫控精確性、升降溫速度等等，更重要的還在于樣品孔之間的均一性，以避免微小的差別被指數級放大。至于熒光檢測系統，多色多通道檢測是當今的主流趨勢——儀器的激發通道越多，儀器適用的熒光素種類越多，儀器適用范圍就越寬;多通道指可同時檢測一個樣品中的多種熒光，儀器就可以同時檢測單管內多模版或者內標+樣品，通道越多，儀器適用范圍越寬、性能就更強大。熒光檢測系統主要包括激發光源和檢測器。激發光源有鹵鎢燈光源、氬離子激光器、發光二極管LED光源，前者可配多色濾光鏡實現不同激發波長，而單色發光二極管LED價格低、能耗少、壽命長，不過因為是單色，需要不同的LED才能更好地實現不同激發波長。監測系統有超低溫CCD成像系統和PMT光電倍增管，前者可以一次對多點成像，后者靈敏度高但一次只能掃描一個樣品，需要通過逐個掃描實現多樣品檢測，對于大量樣品來說需要較長的時間。定量PCR儀需要考慮的另外一個因素是軟件設計，這一點目前較新型號的儀器都有不錯的配套軟件可以滿足常規使用。——隨著定量PCR技術在臨床診斷、疾病監控、藥物監測、腫瘤研究等領域的越來越廣泛的應用，市面上不同品牌和設計的定量PCR儀也不斷推陳出新，生物通在這里著重介紹不同的3類定量PCR儀，各有各精彩。
1. 傳統的96孔板式定量PCR儀
傳統的96孔板式定量PCR儀以美國應用生物系統公司(ABI)為代表。傳統96孔板式定量PCR儀的優點是可容納的樣本量大而且無需特殊耗材，可以采用傳統的96孔板甚至384孔板進行批量的定量反應，但是缺點也顯而易見——溫度均一性不佳——平板固定加熱模塊的PCR溫度控制有邊緣效應——樣品槽上每個孔之間的溫度存在差異——也就是所謂位置效應(可參考生物通龍虎榜：PCR儀的選擇一文)，因此標準曲線的反應條件應難以做到與樣本完全一致，樣本和樣本之間的溫度控制也可能存在差異，對于靈敏度極高的定量PCR來說，任何極微小的差異都會以指數級別的規模被放大，不能不說是一種缺憾。傳統反應板面積大，溫度控制的精確性、升降溫速度也相對較慢，因而反應速度也較慢。96孔板定量PCR儀的熒光檢測分析系統，由于96孔板上樣品孔的位置是固定的，每個樣品孔距離光源和監測器的光程各不相同，有可能對結果產生影響。檢測在試管管底進行，試管底的透光性和厚薄均一性都可能對結果產生影響。MJ和Bio-Red公司的定量PCR儀也屬于這一類。
ABI的7500型熒光定量PCR儀激發光源為鹵鎢燈光源，5色濾光鏡，可同時激發96個樣品，超低溫CCD具備同時多點多色檢測的能力，能夠有效地分辨FAM/SYBR Green I, VIC/JOE, NED/ TAMRA/ Cy3, ROX/Texas Red,和Cy5等。多色熒光檢測技術為多重定量、SNP分析、基因型分型和帶陽性內對照的陰/陽性分析提供了基礎。多重定量即在同一反應管內同時對多個目標基因進行定量，可以大大提高精度并節約成本。隨機配置的定量PCR引物和探針設計軟件Primer Express非常有用，“因為到目前為止還沒有其他軟件有能力設計定量PCR所需的TaqMan探針(生物通摘自ABI技術資料)”。各型號都有實時動態(Real-Time)和終點讀板(Plate Read)兩種運行模式。實時動態模式用于定量DNA或RNA拷貝數。可以動態顯示PCR擴增曲線的生成，定量的線性范圍大于9個數量級，區分5000和10000個拷貝的DNA模板可信度達99.7%。終點讀板模式用于基因型鑒定、點突變檢測和單核苷酸多態性(SNP)分析等。當然，也可以作為普通PCR儀使用。ABI定量PCR儀最大的優勢在于ABI已經發布十二萬種Taqman Gene Expression Assays 人、大鼠、小鼠基因組基因表達分析試劑盒，覆蓋人類全部4萬個基因，二百萬種Taqman Validated SNP Genotyping Assays 人、大鼠、小鼠基因組SNP檢測試劑盒，為運用7000、7300、7500、7900型開展課題研究創造了絕佳的條件。ABI 的定量PCR儀均支持兩種定量化學：TaqMan熒光探針和SYBR Green I熒光染料。其熔解曲線(Dissociation Curve)功能用于判斷PCR擴增反應是否特異，有無雜帶生成。7500型號比7300多一個濾光鏡，新的光路設計使長波長紅色熒光的檢測靈敏度大大提高，帶有快速運行模式。增強的7900型在96孔模塊的基礎上更加可以更換384孔版模塊，使得高通量處理數據的能力大大增強，應該更適合經常處理大量標本的實驗室吧。
MJ的Option系列是在MJ原來的常規PCR儀基礎上改造，采用LED光源PMT光電倍增管熒光檢測器。 96個單色LED光源對應96孔板，但是單色LED激發波長范圍較窄。Option是單道單個光電倍增管熒光檢測器，升級的Option2是雙PMT光電倍增管熒光檢測器，PMT靈敏度高但一次只能掃描一個樣品，所以Option系列是逐孔掃描而非同時檢測96個樣品。雙PMT可同時進行雙色檢測(FAM/SYBR Green I;VIC/Joe/TAMRA)。優勢之一是帶梯度功能。Bio-Rad(伯樂)也算是個熟悉的品牌，iCycler iQ實時定量PCR系統也是96孔平板式固定加熱的，熒光檢測波長范圍400-700nm，可4波長同時檢測，儀器的設計靈活，定性和定量部分可獨立工作，同樣可完成梯度PCR。5組濾光片位置使用戶可以自由選擇不同的檢測波長。專利技術intensifier熒光放大器保證了極高的檢測靈敏度。MJ被Bio-Rad收購后，Option和iCycler iQ目前還是各自走各自的銷售渠道，至于將來Bio-Rad會如何決定二者的發展方向還需要拭目以待。
2.創新概念的離心式實時定量pcr儀
為了克服平板式定量pcr溫度均一性差的缺點，聰明的研究人員又開發出創新概念的離心式實時定量pcr儀，以roche羅氏的lightcycle和corbett的rotor-gene為代表。pcr擴增樣品槽被巧妙地設計為離心轉子的模樣，借助空氣加熱和轉子在腔內旋轉，轉子上每個孔都是“等位”的，幾乎無差別，很好的解決了每個樣品孔之間的溫度均一性的關鍵問題——corbett的rotor-gene樣品間溫度差異小于±0.01℃，最大程度地保障了標準曲線和樣品之間條件的一致性。利用空氣做加熱介質的優點在于能實現與反應體系無縫接觸，接觸面積大且加熱均勻。雖然有競爭對手批評空氣介質比熱小，但事實上roche的lightcycle%202.0卻是目前升溫速度最快的定量pcr儀，可以達到20℃/秒!Corbett的Rotor-gene也可以達到5℃/秒(樣品實際升溫速度達到2.5℃/秒)，優于多數的平板式PCR儀。借助旋轉離心力還可以隨時將可能凝在管壁和蓋子上的液滴離心到管底而無需熱蓋;還可以將酶加在管蓋上，升溫后離心到管底與反應體系混合，實現“機械的熱啟動功能”。由于升溫速度快，對于常規需要2個多小時完成的定量PCR反應，Roche的LightCycler僅需20—30分鐘即可完成，可以大大節約時間和提高工作效率。這一點對于研究人員來說極為有用，因為你不再需要等2個多小時才能看實驗結果了，或者換句話來說，2個多小時你可以做4—5輪定量實驗了。
由于轉子上的樣品孔是旋轉可移動的，因而離心式熒光檢測系統可以固定激發光源和熒光檢測器，隨時檢測旋轉到跟前的樣品管——由于每個樣品管在檢測時距離檢測器和激發光源的距離都是“等價”一樣的，使用的是同一個檢測器和激發光源，有效減少不必要的系統誤差。固定的結構使得儀器運行更穩定，使用壽命更長;離心式定量PCR都是逐個檢測樣品的，所以大多采用了長壽的LED(發光二極管)冷光源，運行前無須預熱，無須校正;系統檢測重復性也更好。
離心式定量PCR儀的缺點主要是離心的轉子小，能容納的樣本量有限，由于是離心式轉子，常規的96孔板和條形管就不適用，有的還需要特殊的消耗品，增加使用成本。當然離心式定量PCR儀不可能帶梯度功能。
Roche的Lightcycler剛推出的時候確實讓人眼前一亮!現在Lightcycler2.0擁有令人心動的優點-----
快速：利用空氣動力學原理，20-30分鐘內完成30-40個循環。
控溫準確：變溫速率最高可達20℃/秒，溫差≤±0.3°C
多波長檢測：可同時在530、640及710nm三個通道進行檢測，實現同管檢測兩個項目或設立檢測項目的外對照和內對照。
此外動態檢測范圍達10個數量級，而無須將樣品稀釋;具有熔點曲線分析功能可以鑒別基因型、檢測點突變、檢測非特異性擴增，具多種檢測模式如Taqman探針、熒光染料SYBR Green I檢測、序列特異雜交探針等;探針及引物設計方便，雜交探針及引物設計的限制少，而且亦可方便地選用合適大小的擴增子(100-1000bp)。但是Lightcycler需要使用特定的毛細管作為樣品管，這在某種程度上提高了消耗成本，也不方便作為常規PCR儀使用。
Corbett的Rotor-Gene也是離心式的定量PCR儀。在品牌的角度上Corbett當然不如Roche羅氏在國內那樣家喻戶曉，之所以特別提到這個產品，確實是因為Corbett的設計有獨到之處。比如Corbett的Rotot-Gene3000標準型是真正獨立的4通道(可建立新通道)，4個獨立LED激發光源(470nm/ 530nm/585nm/625nm)保證最少的光譜交叉 (<1 %)。PMT檢測，6個檢測濾光片，可檢測熒光包括FAM/SYBR Green I, TET，VIC/JOE，HEX，Max， NED/ TAMRA/ Cy3, ROX/Texas Red,和Cy5，Cy5.5等等，機器的適用性非常寬，開放的試劑系統使得機器可適用Taqman探針、熒光染料SYBR Green I檢測、分子信標、FRET探針、Amplifluor探針等等，不像某些牌子的定量PCR儀只能適用Taqman法和熒光。Rotot-Gene3000靈敏度高，寬達12個數量級的線性范圍，可正確區分1、2、3拷貝的基因，重復性極佳(R>0.99935)。由于轉子在反應過程之中一直以恒定的低速旋轉，使得樣品間的溫度均一性極佳(±0.01℃/秒)，同一熱反應室提供完全相同的反應條件，同一光學通路提供完全相同的測量通道，每標本每循環檢測32次，滿足高精度和一致性要求。Rotot-Gene3000提供了36 x0.2ml和72x0.1ml兩種轉子，檢測是通過薄壁管側壁而非管底進行的，因而可以使用普通的0.2ml PCR管，并允許在試管蓋上標記，這降低了使用成本。Rotot-Gene3000的溫控速度不如LightCycler，但優于多數的固定加熱模塊的機型，能達到5℃/秒(管內實際升溫速度達到2.5℃/秒)。Corbett還有一個光學變性專利——讓待擴增樣品預先進行一次熔解曲線程序，檢測熒光染料信號大小的變化，找到代表全部雙鏈DNA解鏈的峰值對應溫度，在其后的反應中就無需總是將變性溫度設為94度，也不需要延長孵育時間。這個專利使得反應過程大大縮短。Rotot-Gene主要的問題也是可容納的樣品數量少，只能靠反應速度快，同樣的時間可以多運行幾輪反應來彌補。對于大量樣品的實驗室，Corbett同時還提供定量PCR反應自動加樣系統，不單可以和自家的Rotor-Gene配套使用提高工作效率和均一性、安全性，也可以配套Roche和ABI的定量PCR儀。這樣就不用擔心加樣累壞了。
3.第三類的熒光定量pcr儀以cepher公司的smart%20cyclerii為代表，對于國內的用戶來說比較新鮮，但這個一直受美國國防部和安全局、美國軍隊傳染病醫學研究中心、美國軍隊士兵和生物化學合作所資助的公司卻相當有來頭。smart%20cyclerii獲得過1998年美國研發r&d100金獎。smart%20cyclerii的機型小巧，只有16個樣品槽，它的獨到之處在于這16個樣品槽分別擁有獨立的智能升降溫模塊，也就是說這16個樣品槽相當于16臺獨立的定量pcr儀!獨立控溫的好處首先是，你可以在同一定量pcr儀上分別進行不同條件的定量pcr反應，更為靈活自定義的梯度優化反應也好，或者是完全不同的幾組反應——甚至，你可能只進行個別樣品的檢測，只占用其中幾個樣品槽——過一會兒其它的同事也要用——他不需要等待你的反應結束，而可以隨時利用空置的樣品槽開始其它定量反應!對于各有各忙的多成員的實驗室，要是個別樣品就占據96孔樣品槽，其它人每輪要再等2個多小時，有時還要等幾輪，那可夠郁悶的。smart%20cycler%20ii的使用頻率可以被最大化，大家都不用等待!這個世界上唯一允許不同條件pcr同時進行的定量pcr儀擁有獨一無二的優點，是其它任何平板式或者離心式定量pcr都不具備的。
此外，每個溫控模塊只控制一個樣品槽，升降溫速度當然更快——高達10℃/秒，控溫精度自然就更高——這里根本不用考慮不同樣品槽之間的溫度均一性的問題，只有每個模塊控溫精確度的問題。對于普通的96孔板固定加熱模塊，本身有控溫精度和準確度的差異，再加上樣品槽不同位置之間的溫度差異，而Smart CyclerII就完全減少了一個誤差因素。優異的特性使得只要20分鐘就可以完成常規的定量PCR反應，大大提高研究人員的工作效率。每個模塊獨立控制的激發光源和檢測器直接與反應管壁接觸，保證熒光激發和檢測不受外界干擾，固定的結構使得儀器運行更穩定，使用壽命更長。整合有4通道光學檢測系統，分別可以檢測FAM/SYBR Green I, Tet/ Cy3, Texas Red和Cy5，可在同一樣本中進行多靶點分析，同時檢測4種熒光信號，可使用多種檢測方法，包括Taqman探針、分子信標、Amplifluor引物和Scorpion引物和熒光內插染料等等。寬達9個數量級的線性范圍。
不過Smart CyclerII需要使用獨家的扁平反應管，增加了反應成本，上樣也不如傳統的方法方便，而且16個樣品槽也不大適合批量反應的要求——不過Smart Cycler II的軟件設計允許一臺電腦同時操作6臺Smart Cycler II，部分彌補了缺憾。所以Smart Cycler II會更適合多成員、樣本量不大、要求快速出結果的實驗室。不是每個實驗室都總是要同時檢測幾十上百個樣品吧?
在選購定量PCR前之前我們需要先了解自己的需要——是同時檢測大量樣本?還是小規模的研究?是固定的標準化檢測方法還是有機會嘗試不同的方法?隨著技術的加速發展不斷有新的熒光素、標記方法和試劑盒面市，還要考慮儀器性能在將來的可拓展性等等。生物通撰寫本文的目的并非指出哪一類的儀器更適合我們的需要——畢竟不同應用領域、不同的實驗室有著不同的需求，所以了解不同類型的定量PCR儀的特點有助于選擇更適合自己需要的儀器，“不求最好，但求適合”。
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